近日，英國約克大學William P. Unsworth和Gideon Grogan報道了生物催化轉化呋喃與胺類化合物為4-吡咯啉-2-酮的反應，可通過I類非特異性過加氧酶artUPO實現。反應適用范圍廣，采用簡單易擴產的過氧化氫驅動方案，且無需外源酶輔因子參與。反應機制可能遵循級聯路徑，UPO介導的呋喃環氧化開環首先生成活性1,4-二羰基中間體，隨后與添加的胺類發生縮合反應，并在UPO活性位點外重排生成吡咯啉酮產物。相關成果發表于ACS Catal.（DOI：10.1021/acscatal.5c05307）。
背景研究：
非特異性過加氧酶（UPOs）是一類血紅素加氧酶，僅依靠外源過氧化氫作為氧源催化有機底物的氧合反應，正逐漸成為規模化合成應用潛力的重要生物催化劑。日益豐富的天然UPOs變體及突變體適用于不同反應需求。根據分子量差異，UPOs可大致分為兩類：I類和II類。作者前期對制備級UPOs氧合反應的研究重點在于比較典型I類與II類UPOs的催化反應特性（Scheme 1A）。與細胞色素P450相似，UPOs同樣展現出超越簡單羥基化反應的"混雜"活性。
本研究報告聚焦于一種新型非特異性UPOs反應的發現：I類artUPO能生物催化轉化呋喃類化合物5與胺類化合物6生成4-吡咯啉-2-酮類化合物7。這代表了一種生物催化領域前所未有的新型轉化，是作者在深入探究I類和II類UPOs分化反應性過程中意外發現的成果。本研究共報道了33種形成吡咯啉酮的新型生物轉化反應。所有生物轉化均在制備規模上進行，采用簡單可放大的工藝方案，以良好產率獲得純品產物。
結果與討論：
本報告所述的新反應活性源于對甲呋酰胺（5a）進行制備級UPO催化氧化的探索研究。5a是一種用于種子處理的殺菌劑，其代謝物研究引起了農化行業合作者的興趣。首先，在pH 7.0水性緩沖體系中，以rAaeUPO-PaDa-I-H和H?O?為氧化劑，在室溫下對5a進行處理。該生物轉化的主要產物是酚類化合物8，分離產率為31%。
然而，在基本相同的條件下使用artUPO進行類似反應時，卻獲得了完全出乎意料的結果：主要產物為吡咯啉酮7a，分離產率達35%（Scheme 2A）。7a中的氮元素很可能來源于artUPO分泌物中夾帶的氨（Scheme 2B）。呋喃類化合物在氧化條件下可發生開環反應生成1,4-二羰基化合物，此類中間體在氨存在下可通過原位縮合反應被捕獲并轉化為7a。4-吡咯啉-2-酮存在三種互變異構形式（Scheme 2C）。對于多數取代模式，3-吡咯啉-2-酮形式9c是最主要的互變異構體。但對于4位連有吸電子基團（如7a）的吡咯啉酮，通常更傾向于形成4-吡咯啉-2-酮互變異構體9a。
據作者所知，在本研究之前尚未報道過制備4-吡咯啉-2-酮的生物催化方法。因此作者研究了生物催化吡咯啉酮形成反應的普適性。首先作者重點探索了氨以外的胺類化合物的適用性（Scheme 3）。在此條件下，5a與乙胺鹽酸鹽6a成功轉化為吡咯啉酮7b。值得注意的是，雖然使用與甲呋酰胺轉化相同的含氨artUPO分泌物，但未觀察到氨加合物7a的生成，這表明外加乙胺在反應中能夠競爭過夾帶的氨。接下來測試了乙胺鹽酸鹽6a與其他取代呋喃的UPO介導反應。甲呋酰胺的酰胺部分可被乙酯取代，吡咯啉酮7c和7d的產率均高于相應的甲呋酰胺轉化反應。呋喃3位取代具有良好的耐受性，可獲得吡咯啉酮7e。酮取代的吡咯啉酮7f也能以良好產率獲得。呋喃4位吸電子基團（5中R2）的存在對實現高效反應至關重要。
接下來重點探索了胺類底物的反應適用范圍（Scheme 4）。所有生物轉化均在制備規模進行。環烴取代的胺類底物均適用該反應，可采用緩慢加胺法或起始直接加胺法（7k-7o）。帶有腈基（7p）、氟烷基（7q）或橋聯雙環基團（7r）的官能化胺類在標準方案下也能良好反應。芳香基和雜芳香基取代的胺類（7t-7v）同樣適用。該轉化反應確實展現出優異的官能團耐受性——能夠成功從多種官能化胺類制備吡咯啉酮。這種廣泛的官能團兼容性證明了氧化-重排級聯反應的普適性，以及UPO對多種活性基團的耐受性。
該反應的可能機理如Scheme 5所示。對照實驗證實artUPO是反應必需條件。因此反應很可能通過artUPO與H?O?反應形成的血紅素Fe(IV)-氧絡合物啟動呋喃氧化。此前在生物催化阿奇莫維奇反應中，已觀察到相關過加氧酶rAaeUPO-PaDa–I-H介導的呋喃氧化開環及后續重排現象(Org. Biomol. Chem. 2024, 22, 6149– 6155)。
本研究可能遵循類似的氧化開環路徑（5b→B→C→D），形成D型不飽和酮醛或其水/胺加合物。D的醛基與胺反應可啟動形成吡咯啉酮的級聯反應，該過程可能涉及多條相關路徑：主要包括亞胺縮合（D→E）、水合環化（E→F）及消除/互變異構（F→7）等步驟。已知非酶促的呋喃氧化生成吡咯啉酮的轉化反應，例如通過單線態氧驅動呋喃開環并經胺捕獲的反應?？紤]到這一點，并結合胺類底物的廣泛兼容性，作者認為胺縮合步驟很可能在反應條件下于UPO活性位點外自發進行。
總結
總而言之，作者開發出首個由artUPO催化的生物催化方法，可實現呋喃類化合物5與胺類化合物6向吡咯啉酮類化合物7的轉化。該工藝適用范圍廣（33個實例），所有生物轉化均采用簡單的室溫方案在制備規模完成。關鍵在于反應無需外源輔因子，以H?O?作為化學計量氧化劑并通過注射泵緩慢滴加。利用該通用方法可獲得多種官能化吡咯啉酮，尤其在胺類底物方面展現出卓越的普適性，證明了UPO對活性胺類具有廣泛耐受性。該級聯反應可能通過初始UPO催化的呋喃氧化開環，隨后在UPO活性位點外與胺發生縮合重排進行。這一新反應進一步擴充了利用UPO實現有用制備級生物轉化的工具庫。
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