KEGG 數(shù)據(jù)庫使用指南（3）——數(shù)據(jù)分析功能進階之從多組學整合到機制解析

富集分析
KEGG
多組學整合

唯思派 2025/10/12

在組學研究中，當我們獲得差異基因或代謝物列表后，如何將這些零散數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為具有生物學意義的通路機制？KEGG 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析功能正是連接數(shù)據(jù)與機制的關(guān)鍵橋梁。相比基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)檢索，KEGG 的分析工具能實現(xiàn)從基因注釋到通路富集、從單一數(shù)據(jù)到多組學整合的深度分析。

本文將系統(tǒng)介紹 KEGG 數(shù)據(jù)分析的核心工具、標準化流程及實戰(zhàn)技巧，特別納入 2025 年最新功能更新，助力研究者高效挖掘數(shù)據(jù)背后的生物學故事。

一、核心分析工具升級亮點

KEGG 持續(xù)優(yōu)化其分析工具矩陣，2025 年重點提升了多組學整合能力和物種覆蓋范圍。在通路數(shù)據(jù)庫（PATHWAY）中，新增了 hormone signaling 通路（2025 年 1 月上線），完善了內(nèi)分泌相關(guān)研究的分析資源。同時擴展了 17 種細菌和 8 種真核生物的物種特異性通路，包括大西洋鯖魚（ssco）、十三線地松鼠（iti）等模式生物，使非模式生物研究也能獲得精準的通路注釋。

KEGG Mapper作為最常用的通路映射工具，新增了 "多物種比較模式"。研究者可同時輸入人類（hsa）、小鼠（mmu）的基因列表，在同源通路圖上用不同顏色標記跨物種的基因表達變化，直觀展示進化保守的調(diào)控模塊。操作時只需在 "Organism" 參數(shù)中輸入多個物種代碼（如 hsa,mmu），工具會自動匹配 KO 系統(tǒng)的同源基因。

Pathview 包的 2025 版強化了多組學數(shù)據(jù)整合功能。不僅支持基因與代謝物數(shù)據(jù)的同圖可視化，還能處理多達 6 個樣本的比較分析。通過設置multi.state = TRUE參數(shù)，可將基因節(jié)點和化合物節(jié)點分割為多個片段，用熱圖漸變顏色展示不同樣本的表達差異。例如在乳腺癌研究中，可同時展示 3 個腫瘤樣本與 3 個正常樣本在糖酵解通路上的基因表達和代謝物濃度變化，清晰識別樣本分組特異性的通路異常。

BlastKOALA工具優(yōu)化了宏基因組數(shù)據(jù)的注釋算法，針對腸道菌群等復雜樣本，新增了 "功能冗余度計算" 參數(shù)，能量化不同菌株在同一通路中的功能補償效應，這對微生物組研究的通路活性分析尤為重要。

圖片來源：Minoru Kanehisa, Yoko Sato, Kanae Morishima, BlastKOALA and GhostKOALA: KEGG Tools for Functional Characterization of Genome and Metagenome Sequences, Journal of Molecular Biology, Volume 428, Issue 4, 2016, Pages 726-731, ISSN 0022-2836, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2015.11.006.

二、標準化分析流程實戰(zhàn)

1. 數(shù)據(jù)預處理：ID 轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵技巧

KEGG 分析的準確性始于正確的 ID 格式。2025 年通路注釋數(shù)據(jù)顯示，采用官方認可的 ID 類型可使映射率提升至 99.2%。對于 RNA-seq 數(shù)據(jù)，建議將基因名轉(zhuǎn)換為 Entrez ID 或 UniProt ID：人類基因用hsa:10458格式，小鼠基因用mmu:12345格式。轉(zhuǎn)換工具推薦使用 UniProt 的 ID mapping 功能，設置 "From" 為 Gene name，"To" 為 UniProtKB，"Organism" 限定物種。

代謝組數(shù)據(jù)需將化合物名稱轉(zhuǎn)換為 KEGG C 編號。例如 "乳酸" 對應 C00186，"ATP" 對應 C00002。可通過 KEGG COMPOUND 數(shù)據(jù)庫的批量檢索功能，或使用 R 包MetaboAnalystR的convertCompoundID函數(shù)實現(xiàn)批量轉(zhuǎn)換。對于非標代謝物，可通過精確分子量在 KEGG COMPOUND 中模糊搜索可能的匹配項。

2. 通路富集分析的核心參數(shù)

富集分析本質(zhì)是通過超幾何檢驗判斷目標基因在特定通路中的分布是否具有統(tǒng)計學顯著性。使用clusterProfiler包的enrichKEGG函數(shù)時，關(guān)鍵參數(shù)設置如下：

● organism="hsa"：指定物種，代謝物分析需設為"cpd"

● pvalueCutoff=0.05：原始 p 值閾值

● qvalueCutoff=0.2：多重檢驗校正后的閾值

2025 年更新的enrichKEGG函數(shù)已支持代謝物富集分析，直接輸入 C 編號列表即可。例如：

需注意代謝物分析需使用最新版 clusterProfiler（≥4.6.0）。

3. 結(jié)果可視化的多層次呈現(xiàn)

顯著富集通路的展示需兼顧統(tǒng)計顯著性與生物學意義：

● 氣泡圖：用dotplot()函數(shù)繪制，X 軸為基因比率，點大小表示基因數(shù)，顏色映射 q 值

● 通路著色圖：通過 Pathview 生成，設置gene.data和cpd.data參數(shù)實現(xiàn)基因 - 代謝物共展示

● 層級樹狀圖：利用 KEGG BRITE 的分類體系，用treeplot()展示通路間的功能關(guān)聯(lián)

對于多組學數(shù)據(jù)，推薦使用 Pathview 的 Graphviz 視圖（設置kegg.native = FALSE），該模式用橢圓表示化合物節(jié)點，矩形表示基因節(jié)點，箭頭方向清晰展示代謝流方向。

三、深度解讀策略與案例分析

1. 關(guān)鍵指標的生物學解讀

富集結(jié)果中的富集因子（Rich factor）反映通路被關(guān)注基因覆蓋的程度，例如富集因子 2.5 表示目標基因集中該通路的基因比例是背景基因的 2.5 倍。q 值需嚴格控制在 0.05 以下，避免假陽性結(jié)果。在腫瘤研究中，若 hsa04110 細胞周期通路 q=0.002 且包含 15 個差異基因，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)可推測該通路異常可能促進細胞增殖。

需特別注意通路的層級關(guān)系：map 開頭的全局通路（如 map01230）適合初步篩選，物種特異性通路（如 hsa01230）適合深入分析。2025 年新增的激素信號通路可與經(jīng)典通路關(guān)聯(lián)分析，例如乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)雌激素信號通路（hsa04960）與細胞周期通路存在交叉調(diào)控。

2. 多組學整合案例

以肝癌多組學研究為例，完整分析流程包括：

1. 用 BlastKOALA 注釋轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得差異基因的 KO 編號

2. 通過enrichKEGG發(fā)現(xiàn) hsa00010 糖酵解通路顯著富集（q=1.3e-6）

3. 用 Pathview 整合糖酵解通路的基因表達（HK2 上調(diào) 2.8 倍）和代謝物數(shù)據(jù)（乳酸 C00186 升高 1.7 倍）

4. 在通路圖中發(fā)現(xiàn) NAD+/NADH 比值異常，結(jié)合 LinkDB 關(guān)聯(lián)到 SIRT1 基因的表達變化

該案例通過 KEGG 分析將基因表達異常與代謝表型關(guān)聯(lián)，揭示了 "Warburg 效應" 在肝癌中的分子機制。

四、進階技巧與常見問題解決

1. 批量分析與自動化工具

對于高通量數(shù)據(jù)，KEGG REST API 可實現(xiàn)批量處理：

● 獲取人類所有通路列表：http://rest.kegg.jp/list/pathway/hsa

● 批量注釋基因 KO：http://rest.kegg.jp/link/ko/hsa:10458

● 導出通路圖片：http://rest.kegg.jp/get/hsa04110/image

R 語言用戶可結(jié)合httr包編寫循環(huán)腳本，實現(xiàn)數(shù)百個基因的自動化注釋。

2. 常見問題解決方案

映射率低：檢查 ID 格式是否包含物種前綴（如 hsa:），嘗試轉(zhuǎn)換為不同 ID 類型重試；

無顯著通路：適當放寬 p 值閾值至 0.1，或增加樣本量；

代謝物注釋不全：使用 KEGG COMPOUND 的 "Similar compounds" 功能查找同源物。

KEGG 數(shù)據(jù)分析功能已從單一通路注釋發(fā)展為多組學整合平臺。掌握這些工具不僅能高效完成常規(guī)富集分析，更能深入挖掘基因 - 代謝物 - 通路之間的調(diào)控網(wǎng)絡。建議定期查看 KEGG 更新日志（https://www.kegg.jp/kegg/docs/updnote.html），及時利用新增的物種數(shù)據(jù)和分析功能。

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