柱層析技術也稱柱色譜技術。一根柱子里先填充不溶性基質形成固定相，將樣品加到柱子上后用特別的溶劑洗脫，溶劑組成流動相。在樣品從柱子上洗脫下來的過程中，根據混合物中各組分在固定相和流動相中的分配系數不同經過多次反復分配，將不同組分逐一分離。硅膠層析法的分離原理是根據物質在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質易被硅膠吸附，極性較弱的物質不易被硅膠吸附，整個層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程。根據填充基質和樣品分配交換原理不同，離子交換層析，凝膠過濾層析和親和層析是三種分離混合物的經典層析技術。

柱層析分離凈化的實驗技巧和方法

1　柱層析操作方法的選擇

　　目前 ,柱色譜分離的操作方式 主要包括常壓分離、減壓分離和加壓分離三種模式。加壓柱: 適合小于100-200g產品的純化。大尺寸的加壓柱難以制作，用起來危險性大。建議使用雙鏈球加壓。減壓柱: 適合任何量的過柱，比加壓柱快，需要減小流動相極性過柱(比加壓柱小一倍)，不然會導致分離效果差。常壓柱: 適合大于50-100g的產品。常壓柱是分離效果最好的，但是時間也最長。常壓分離是最簡單的分離模式方便、簡單 ,但是洗脫時間長。減壓分離盡管能節省填料的使用量 ,但是由于大量的空氣通過填料會使溶劑揮發 ,并且有時在柱子外面會有水汽凝結 ,以及有些易分解的化合物也難以得到 ,而且還必須同時使用水泵或真空泵抽氣。加壓分離可以加快淋洗劑的流動速度 ,縮短樣品的洗脫時間 ,是一種比較好的方法 ,與常壓柱類似 ,只不過外加壓力使淋洗液更快洗脫。壓力源可以是壓縮空氣 ,雙連球或者小氣泵等。

2　柱子規格的選擇

　　市場上有各種規格的柱層析分離柱。柱子長了 ,相應的塔板數就高 ,分離就好。目前市場上的柱子 ,其徑高比一般在1: 5～10范圍 ,在實際使用時 ,填料量一般是樣品量的 30～70倍 ,具體的選擇要根據樣品的性質和含量進行具體分析。如果所需組分和雜質的分離度較大 ,就可以減少填料量 ,使用內徑相對較小的柱子 (如 2 cm × 20 cm的柱子 ) ; 如果 Rf相差不到 0.1, 就要加大柱子 ,增加填料量 ,比如用 3 cm內徑的柱子。200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠。干硅膠的密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。

3　裝柱

　　柱層析色譜柱的填裝主要有濕法和干法兩種 ,濕法省事 ,不論干法還是濕法，硅膠（固定相）的上表面一定要平整。濕法裝柱是先把硅膠用適當的溶劑拌勻后，再填入柱子中，然后再加壓用淋洗劑"走柱子"，本法最大的優點是一般柱子裝的比較結實，沒有氣泡。 干法裝柱則是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側，至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至合適高度，最后再用油泵直接抽，這樣就會使得柱子裝的很結實。接著是用淋洗劑"走柱子"，一般淋洗劑是采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。通常上面加壓，下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。干法裝柱較方便，但最大的缺陷在于"走柱子"時，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺到），容易產生氣泡，這一點在使用低沸點的淋洗劑時如乙醚，二氯甲烷更為明顯。雖然產生的氣泡在加壓的情況下不易察覺，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時候，氣泡就會釋放出來，嚴重時，整個柱子變花，樣品不可能平整地通過，當然也就談不上分離了。解決的辦法是：第一、硅膠一定要填結實；第二、一定要用較多的溶劑"走柱子"，一定要到柱子的下端不再發燙，恢復到室溫后再撤去壓力。 也有介紹在硅膠的最上層填上一小層石英砂，防止添加溶劑的時候，使得樣品層不再整齊。但我的感覺是如果小心上樣，添加溶劑，則沒有這個必要。柱子底端的活塞一定不要涂潤滑劑 ,否則會被淋洗劑帶到淋洗液中 ,可以采用聚四氟乙烯材料的閥門。干法和濕法裝柱沒什么實質性差別,只要能把柱子裝實就行。裝完的柱子應該有適度的緊密(太密了淋洗劑流速太慢 ) ,并且一定要均勻 ,不然樣品就會從一側斜著流動。同時柱中不能有大氣泡 ,大多數情況下有些小氣泡沒太大的影響 ,因為只要加壓氣泡就可消失。但是柱子更忌諱的是開裂 ,開裂會影響分離效果 ,甚至報廢。

4　上樣

上樣也有干法和濕法之分：干法就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。濕法上樣就是用少量溶劑（最好就是展開劑，如果展開劑的溶解度不好，則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，再用膠頭滴管轉移得到的溶液，沿著層析柱內壁均勻加入。待溶劑層下降至石英砂面時 ,再加少量的低極性溶劑 ,然后再打開活塞 ,如此兩三次 ,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑 ,一開始不要加壓 ,等溶解樣品的溶劑和樣品層有一段距離 (2～4 cm) ,再加壓 ,這樣避免了溶劑 (如二氯甲烷等 )夾帶樣品快速下行。很多樣品在上柱前粘性較大 ,上樣后在柱上又會析出 ,這一般都是比較大量的樣品才會出現 ,是因為填料對樣品的吸附飽和所致。有些樣品溶解性差,能溶解的溶劑 (比如 DMF,DMSO等)又不能上柱 ,這樣就必須用干法上柱了。

5　溶劑的選擇

極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統；極性較大的用甲醇：氯仿系統；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。某種樣品在這種展開劑中只顯示一個點，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個點。因此在尋找展開劑時，多嘗試幾種比例不同，成分不同的展開劑。展開劑的極性太小，點分不開，極性太大，也分不開。淋洗劑一般采用TLC分析（Rf=0.2~0.3）得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。由于層析柱和薄板的不同，即使兩者使用的硅膠都相同，但是在把TLC分析得到的展開劑用在柱層析時，也顯得極性偏大，所以要稀釋一倍，但又不能稀釋太多，否則成了靠擴散作用來分離，效果也不會好。

　　選擇一個合適的溶劑系統是柱層析分離的關鍵。在選用柱層析洗脫劑時首先要考慮三個方面的因素: 溶解性，親合性 和分離度 (Resolution)。溶劑應選擇價廉、安全、環保的 ,可以考慮石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷價格較高 ,乙醚很易揮發 ,二氯甲烷和甲醇與硅膠的吸附是一個放熱過程 ,易使柱子產生氣泡。其他的溶劑用的相對較少 ,要依不同需要選擇。一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用單一溶劑，往往不能達到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區分度的作用，常用的溶劑組合有：Petroleumether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleumether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate。一般把兩種溶劑混合時,采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開的跡象,再調整比例,達到最佳效果，如果沒有分開的跡象，最好是換溶劑。

6　淋洗液的收集和濃縮

　　用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。如果樣品與硅膠的吸附比較強的話 ,就不容易流出 ,這時可以采用氧化鋁作固定相。柱層析后的淋洗液 ,由于使用了較多的溶劑 ,必須進行濃縮 ,如果待測物具有一定的揮發性 ,最好使用常壓揮發溶劑 ,否則易導致檢測結果偏低。

7 監測顯色

一邊收集樣品，一邊進行薄層色譜分析。找到相應的產物點，濃縮得到產物，進行表征，分析確認。可以參照相關文章鏈接：TLC薄層層析技術, 有機合成中常用TLC顯色劑匯總

8 注意事項

1. 先根據TLC方法篩選好洗脫劑，使兩相鄰物質Rf值之差最大化

2. 將柱子必須裝平整、均勻

3. 考慮有限柱填料的吸附量

4. 可考慮用梯度法分開并洗脫

5. 敏感化合物可以嘗試氧化鋁充填過柱(比如醛，容易開環的化合物)效果不錯缺點是氧化鋁的吸附能力稍差。需要降低流動相極性2-5倍。

6. 容易掉Boc基團的化合物，請用三乙胺堿化硅膠柱子后再過柱

7. 酸性化合物加1/1000醋酸、堿性化合物加1/1000-1/100氨水或者三乙胺或氨甲醇。

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